1940年10月19日，蒋介石指使何应钦、白崇禧以国民党政府军事委员会正、副参谋总长名义致电八路军朱德、彭德怀和新四军叶挺、项英，强令将在黄河以南的八路军、新四军于1个月内开赴黄河以北。这明显地暴露了国民党制造分裂、挑动内战的险恶用心。11月9日，朱德、彭德怀、叶挺、项英复电何应钦、白崇禧，据理驳斥了国民党的无理要求，但为顾全大局，仍答应将皖南新四军部队开赴长江以北。而蒋介石对此不予理睬，仍按原定计划密令第三战区顾祝同、上官云相将江南新四军立即“解决”。1941年1月4日，皖南新四军军部直属部队等9千余人，在叶挺、项英率领下开始北移。1月6日，当部队到达皖南泾县茂林地区时，遭到国民党7个师约8万人的突然袭击。新四军英勇抗击，激战7昼夜，终因众寡悬殊, 弹尽粮绝，除傅秋涛率2000余人分散突围外，少数被俘，大部壮烈牺牲。军长叶挺被俘，副军长项英、参谋长周子昆突围后遇难，政治部主任袁国平牺牲。这就是震惊中外的皖南事变，是国民党第二次反共高潮的高峰。事变发生后，蒋介石于1941年1月17日发布命令，宣布新四军为“叛军”，取消新四军番号，下令进攻新四军江北部队。中国共产党对此进行了坚决的回击，命令重建新四军军部，任命陈毅为代理军长，刘少奇为政治委员。不久，新四军新军部在苏北盐城正式成立。随后，新四军扩编为9万余人。同时，毛泽东以中央军委发言人的名义发表谈话，揭露蒋介石发动皖南事变的真相。在一片反对声中，国民党蒋介石集团更陷于孤立。1941年3月，蒋介石被迫“保证”决不再有“剿共”的军事行动。至此，国民党发动的第二次反共高潮被彻底击退。